人體的新陳代謝功能是通過復雜的、分級三維（3D）血管網(wǎng)絡(luò)輸送氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)以及清除廢物來維持的。分級血管網(wǎng)絡(luò)最大限度地增加了代謝物擴散的表面積，同時也最大限度地減少了流體對流的阻力。因此，通過工程化手段體外構(gòu)建分層血管網(wǎng)絡(luò)是體外重構(gòu)組織器官的基礎(chǔ)。

近日，美國萊斯大學Jordan S. Miller團隊在Nature Biomedical Engineering期刊發(fā)表題為“Generation of Model Tissues with Dendritic Vascular Networks via Sacrificial Laser-sintered Carbohydrate Templates”的文章，報道了使用糖粉犧牲材料結(jié)合激光燒結(jié)技術(shù)制造樹突狀網(wǎng)絡(luò)支架，然后灌注載細胞水凝膠構(gòu)建樹突狀血管網(wǎng)絡(luò)組織模型。這項研究證明樹突血管網(wǎng)絡(luò)可以維持超過1cm厚的組織模型中細胞代謝活性，為研究血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、代謝物轉(zhuǎn)運和組織功能之間的關(guān)系提供了新的模型策略。

背景介紹

血管網(wǎng)絡(luò)是人體的重要組成部分，保證組織器官的營養(yǎng)和氧氣的供應。較早的研究采用軟光刻和插針管的方式構(gòu)建血管通道，隨著工程技術(shù)的發(fā)展和新材料的出現(xiàn)而逐漸淘汰，目前的研究手段聚焦于增材制造在血管化模型構(gòu)建中的應用。構(gòu)建給定的血管化通道可以通過噴墨、擠出工藝，懸浮打印工藝，立體光刻工藝，激光燒結(jié)等技術(shù)實現(xiàn)。其中激光燒結(jié)技術(shù)指以激光為熱源對粉末壓坯進行燒結(jié)的技術(shù)，具有成型速度快、精度高等優(yōu)勢，非常適合構(gòu)建復雜血管通道。Jordan S. Miller團隊模擬生理狀態(tài)下血管分支結(jié)構(gòu)，利用激光燒結(jié)技術(shù)將糖粉材料燒結(jié)成復雜網(wǎng)絡(luò)的糖支架。然后用水凝膠包裹糖支架，在給定條件下溶解該支架形成空腔，最后在空腔內(nèi)灌注血管內(nèi)皮細胞形成完整的樹突狀血管網(wǎng)模型。利用燒結(jié)技術(shù)可以構(gòu)建諸如分層網(wǎng)絡(luò)等復雜的拓撲結(jié)構(gòu)，既為體外長期培養(yǎng)大尺度組織模型提供新的解決方案，也為研究血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在組織代謝中的功能提供可能。

實驗結(jié)果

1.基于糖犧牲材料的激光燒結(jié)技術(shù)流程

實驗中使用的是糖犧牲材料的基礎(chǔ)成分是異麥芽粉（Isomalt powder），但是異麥芽粉與標準激光燒結(jié)材料（如尼龍）相比具有更高的粘性（圖1d），需混合抗凝結(jié)劑（二氧化硅，玉米淀粉和黃原膠）以稀釋其粘性。然后糖粉末由粉末分裝器和振動篩槽均勻地噴灑在指定區(qū)域，通過激光燒結(jié)構(gòu)筑成型（圖1a）。所構(gòu)建的糖支架具有異質(zhì)3D分支，曲率光滑和無支撐幾何體的特性（圖1b）。該支架同時具有一定的硬度和脆性，其彈性模量約為600MPa，足以支撐其自身重量并完成后續(xù)的水凝膠灌注。該團隊還更新了OpenSLS的硬件和固件，使其能編碼區(qū)域特定的燒結(jié)參數(shù)，更適合進行糖粉的激光燒結(jié)（圖1e）。

2.基于糖犧牲材料的激光燒結(jié)技術(shù)后處理和特性表征

燒結(jié)后的糖支架表面顆粒感強，使用濃縮異麥芽糖溶液處理后可以快速抹平表面而不會影響整個結(jié)構(gòu)（圖1f）。接下來，該團隊評估了激光參數(shù)和幾何結(jié)構(gòu)之間關(guān)系。實驗結(jié)果總結(jié)了從厘米（圖1b，圖1c）到百微米（圖1g）范圍內(nèi)的糖支架制造參數(shù)。尤其糖絲直徑在400 -800微米范圍內(nèi)，固定功率密度為45Wmm2時，激光移動速度和糖絲直徑之間存在近似線性關(guān)系（圖1g，圖1h）。

圖1. 基于激光燒結(jié)技術(shù)的糖支架設(shè)備搭建和制作流程。

3.基于激光燒結(jié)技術(shù)的糖支架犧牲性檢測

為驗證燒結(jié)并光滑處理后的糖材料具有犧牲性，該團隊通過燒結(jié)制作簡單的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，然后用不同的材料包裹網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。在外殼材料凝固后，加水或者PBS溶解糖材料。結(jié)果表明，糖材料可被PDMS、PCL、PEGDA、瓊脂、絲素蛋白、纖維蛋白等多種材料或水凝膠包裹，并且溶解后的管道均有良好的連通性（圖2a - 圖2c）。然后該團隊制造嘗試構(gòu)建復雜的拓撲結(jié)構(gòu)，在可控性較差的瓊脂材料中分別成功構(gòu)建了二維多通道、三維分層通道和三維獨立通道等復雜結(jié)構(gòu)。以上實驗說明了基于糖粉末的激光燒結(jié)技術(shù)具有在多種水凝膠中構(gòu)建復雜血管通道的可能。

圖2. 燒結(jié)后糖支架在分支網(wǎng)絡(luò)和多血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中的犧牲性檢測。

4.樹突狀血管網(wǎng)設(shè)計

為模擬生理條件下的動脈-靜脈血管網(wǎng)絡(luò)，該團隊采用了葉脈分支模型來計算分支血管拓撲結(jié)構(gòu)。簡言之，在一個橢圓模型內(nèi)假定兩個葉脈生長點并假定其隨機延伸（圖3a），當兩個生長束接近時，它們的末端分支相互吸引（圖3b）并會聚形成閉合網(wǎng)絡(luò)（圖3c）。但是網(wǎng)絡(luò)管道厚度的計算遵從Murray定律而獨立于葉脈網(wǎng)絡(luò)生長步驟（圖3d）。經(jīng)過對該網(wǎng)絡(luò)的流動性評估后發(fā)現(xiàn)，該網(wǎng)絡(luò)可以有效地將流量分布在所有通道中（圖3e），即分叉的流體在分支中呈現(xiàn)出較低的速度，而會聚的流體獲得速度則是分支速度之和（圖3f）。另外，研究結(jié)果表明通道中的最大速度和壁面剪應力是一致的，證明了整個網(wǎng)絡(luò)中的流體流動是均勻分布的（圖3g）。該團隊還發(fā)現(xiàn)通過標準計算流體力學（CFD）可模擬上述流動性評估結(jié)果，于是提出了將CFD用于模擬和預測血管流動性的可能。文章作者最后通過檢查三個單獨的粒子圖像測速（PIV）實驗，證明了該網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的可重復性（圖3i，圖3j）。

圖3. 基于葉脈分支模型的樹突狀血管網(wǎng)絡(luò)模擬。

5.激光燒結(jié)糖支架血管網(wǎng)絡(luò)載細胞培養(yǎng)

在獲得穩(wěn)定構(gòu)建血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的工藝參數(shù)后，該團隊開始進行載細胞實驗。血管網(wǎng)外層水凝膠中混有被mOrange標記的IMR-90成纖維細胞，血管通道內(nèi)皮通過灌注種植GFP標記的內(nèi)皮細胞（HUVEC）。經(jīng)過11天的灌注培養(yǎng)后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HUVEC在管腔內(nèi)長勢良好，并有向水凝膠內(nèi)萌發(fā)的趨勢。進一步的評估表明，HUVEC均勻地覆蓋在網(wǎng)絡(luò)的各個分支（圖4c，圖4d）和通道的整個周長（圖4e）周圍。接下來，該團隊在同一個血管網(wǎng)糖支架上的不同區(qū)域用不同的水凝膠包裹，構(gòu)建出一個液體互通的異源材料血管網(wǎng)組織模型，證明了糖支架激光燒結(jié)技術(shù)在構(gòu)建不同組織交界面模型的潛力（圖4f）。

圖4. 糖支架血管網(wǎng)絡(luò)具有良好的細胞培養(yǎng)活性。

6.載細胞水凝膠中細胞代謝的區(qū)域異質(zhì)性

為深入了解灌注水凝膠中不同細胞密度下的代謝活性，該團隊通過激光燒結(jié)技術(shù)制造單管道水凝膠（圖5a）。水凝膠中混合不同密度的HepG2肝細胞，在第0天、第3天、第7天后通過MTT染色研究細胞代謝活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靠近單管道的細胞一直維持較高的代謝活性而其他區(qū)域的代謝活性從第3天開始減弱（圖5b，c）。對低細胞密度水凝膠的研究顯示，從第3天開始管道附近的細胞密度、代謝活性（圖5d，圖5e）開始加速上升，而高細胞密度水凝膠中第3天和第7天的細胞密度沒有顯著變化，可能原因是水凝膠中細胞密度過高而很快達到飽和。同時第7天的結(jié)果還表明，在不同細胞密度的水凝膠中其代謝活性半徑和總代謝水平隨著時間的推移趨于相同（圖5f，圖5g），并總結(jié)了細胞活性與通道距離之間的簡單函數(shù)關(guān)系（圖5h）。

圖5. 載細胞水凝膠中細胞代謝活性評估。

7.載細胞水凝膠樹突狀血管網(wǎng)灌注培養(yǎng)研究

該團隊同樣通過燒結(jié)技術(shù)構(gòu)建樹突狀血管網(wǎng)支架并包埋于2%瓊脂糖膠中，并驗證了該結(jié)構(gòu)的通道流動性（圖6a – 圖6d）。然后，將該支架包埋于載HepG2細胞的水凝膠中，觀察到3天后樹突狀網(wǎng)絡(luò)周圍細胞代謝活性增強（圖6e）。該團隊進一步開發(fā)了一個圖像處理工作流程，將整個凝膠的代謝活動進行可視化，并發(fā)現(xiàn)樹突狀血管網(wǎng)存在灌注不充分的區(qū)域。其可能原因是該區(qū)域上游管道本身灌注不足導致的（圖6f – 圖6h）。

圖6. 樹突狀血管網(wǎng)絡(luò)的制備、灌注和載細胞培養(yǎng)分析。

8.樹突狀血管網(wǎng)絡(luò)灌注培養(yǎng)支持原代肝細胞維持代謝活性

首先，該團隊制作簡單的多通道水凝膠，水凝膠中植入小鼠原代肝細胞。相比于靜態(tài)培養(yǎng)，通過灌注培養(yǎng)的原代肝細胞維持更高的代謝活性和更真實的蛋白表達，細胞之間的間隙也更為緊密，同時也表達更高的白蛋白水平（圖7a-圖7g）。然后，該團隊制作了1.5cmx 3.8cm大尺度樹突狀網(wǎng)絡(luò)培養(yǎng)小鼠原代肝細胞（圖h）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細胞主要聚集在管道周圍生長（圖7i，圖7j），這些細胞在培養(yǎng)7天后細胞仍然維持白蛋白分泌功能和緊密的團簇結(jié)構(gòu)（圖7l – 圖7n）。進一步分析發(fā)現(xiàn)該團簇代謝活性在培養(yǎng)3天達到最高，培養(yǎng)7天后出現(xiàn)明顯下降。同時E-cadherin表達檢測也證實了代謝的變化（圖7j，圖7k）。

圖7. 樹突狀血管網(wǎng)絡(luò)灌注支持原代肝細胞體外培養(yǎng)。

總結(jié)

在這項研究中，Jordan S.Miller團隊證明了通過激光燒結(jié)制作的糖支架可被用于構(gòu)建復雜的通道網(wǎng)絡(luò)用于模擬人體的血管系統(tǒng)。該技術(shù)采用犧牲材料灌注的方法構(gòu)建水凝膠結(jié)構(gòu)，使得體外構(gòu)建任意血管拓撲結(jié)構(gòu)成為可能。激光燒結(jié)技術(shù)克服了擠壓技術(shù)在復雜結(jié)構(gòu)和多層結(jié)構(gòu)上的制造限制，從而實現(xiàn)具有仿生功能的三維分級、分支血管網(wǎng)絡(luò)。

參考文獻

Generationof model tissues with dendritic vascular networks via sacrificiallaser-sintered carbohydrate templates[J]. Nature Biomedical Engineering, 2020:1-17.

DOI：10.1038/s41551-020-0566-1