基于其高靈敏度和便攜性，細胞傳感器已成為傳統(tǒng)毒物毒性評價的一種具有吸引力的評估手段。近年來，許多研究表明三維的細胞培養(yǎng)環(huán)境可以更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境，從而更準確地監(jiān)測細胞對外源性危害的反應(yīng)。在三維細胞傳感器的設(shè)計上，海藻酸鈉、鼠尾膠原和瓊脂糖等天然水凝膠常常被用以細胞在電極上的固定化。然而，這些水凝膠通常導電性和可塑性較差，且極易從電極表面脫落分離。此外，通過人工來修飾電極也會給測試結(jié)果帶來很大的個體誤差。因此，如何提高有效性、穩(wěn)定性及實現(xiàn)可批量性生產(chǎn)仍是生物傳感器研發(fā)的一項挑戰(zhàn)。

來自江南大學的孫秀蘭教授團隊在“Bioelectrochemistry”上發(fā)表的“3D ‘honeycomb’ cell/carbon nanofiber/gelatin methacryloyl (GelMA) modified screen-printed electrode for electrochemical assessment of the combined toxicity of deoxynivalenol family mycotoxins”一文中，研究人員將3D打印技術(shù)引入生物傳感器的構(gòu)建過程，實現(xiàn)了精確、快速、可批量化地生產(chǎn)真菌毒素的毒性分析工具的目的。該方法是利用碳納米纖維/明膠甲基丙烯酰基（GelMA）復合導電水凝膠構(gòu)建了三維細胞培養(yǎng)體系，通過電化學交流阻抗法測定其阻抗值判斷細胞受毒素刺激后的受損情況，從而真實、有效地評價真菌毒素細胞毒性。結(jié)合聯(lián)合指數(shù)法（CI）對DON、3-ADON及15-ADON的聯(lián)合毒性分析，并判定聯(lián)合作用類型。結(jié)果表明，該方法操作簡便、可重復性強，顯示了高通量在線檢測分析的潛力，為真菌毒素的細胞毒性評估提供了一種新思路。

圖1 細胞電化學傳感器的構(gòu)建過程及其表征

首先，研究人員利用EFL團隊提供的擠出式生物3D打印機（EFL-BP-6601）和GelMA生物墨水（EFL-GM-60）制備了一種電化學傳感器，并對其實驗條件進行了相關(guān)的優(yōu)化。為提高絲網(wǎng)印刷電極（SPCE）的電化學靈敏度，金納米粒子（AuNP）被電鍍在SPCE的工作電極上，并通過摻入碳納米纖維進一步提高GelMA水凝膠的導電性。打印填充方式的優(yōu)化中，“蜂巢”型的打印填充方式顯示出了優(yōu)于其他填充方式的導電性能。A549細胞/碳納米纖維/GelMA復合水凝膠通過3D打印程序被精確沉積于8通道絲網(wǎng)印刷電極的工作電極上，從而得到細胞電化學傳感器。水凝膠為細胞提供了類體內(nèi)的生長環(huán)境并能促進細胞間相互作用。完整細胞膜的存在防止了氧化還原探針進入電極表面，從而增加了電子傳遞阻力。當霉菌毒素刺激細胞時，發(fā)生細胞凋亡和死亡。因此，電子轉(zhuǎn)移加快了工作電極的導電率，根據(jù)細胞傳感器的阻抗值便可測得真菌毒素的細胞毒性。

其次，由于不同濃度的GelMA水凝膠會表現(xiàn)出不同的加工性能和生物相容性特征，研究人員評估了不同濃度的GelMA水凝膠的電導率及其對細胞活力的影響。結(jié)果表明，隨著GelMA濃度的增加，絲網(wǎng)印刷電極的電流值降低（圖2A），可見高濃度的GelMA不利于電子傳輸?；?死細胞染色分析（圖2C）可發(fā)現(xiàn)，細胞在低濃度（5％-7.5％）的GelMA水凝膠中生長良好，并能觀察到細胞分化過程中的形態(tài)變化，細胞聚集成簇（如紅色框所示）。經(jīng)統(tǒng)計分析（圖2B），A549細胞在5％-7.5％濃度的GelMA水凝膠中的存活率更高，超過93％。

圖2 不同GelMA濃度的電導率和生物相容性的比較

最后，將構(gòu)建的細胞傳感器暴露于不同濃度的DON、3-ADON和15-ADON中，以分析每種霉菌毒素的毒性。構(gòu)建的電化學毒性評價方法表明，真菌毒素降低了A549細胞的活性（圖3）。在三種霉菌毒素中，DON最有效地降低細胞活力，而3-ADON表現(xiàn)出最弱的細胞毒性。三種真菌毒素的半數(shù)致死率（IC50）如下：DON 0.9353 μg/ mL、3-ADON12.3194 μg/ mL和15-ADON1.3360 μg/ mL。為評估構(gòu)造的細胞電化學傳感器的準確性，將本方法獲得的結(jié)果與傳統(tǒng)毒性評價方法CCK-8獲得的結(jié)果進行了比較，可見兩種方法的結(jié)果具有良好的一致性。

使用所構(gòu)建的電化學方法進一步對DON、3-ADON和15-ADON的聯(lián)合毒性進行研究。圖4顯示了兩種或三種不同濃度比例的DON及其衍生物組合的聯(lián)合細胞毒性作用。采用CI聯(lián)合指數(shù)模型分析了各毒素組合的聯(lián)合毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，DON +3-ADON、DON +15-ADON和DON +3-ADON + 15-DON的混合物對A549細胞產(chǎn)生幾乎完全拮抗的細胞毒性，而3-ADON和15-ADON的組合在低細胞抑制水平上發(fā)揮協(xié)同作用，而在中高細胞抑制水平則產(chǎn)生拮抗作用。

圖3 A549細胞暴露于DON、3-ADON和15-ADON后的細胞抑制率曲線（以CCK-8法和構(gòu)建的電化學方法作為比較）

圖4 DON、3-ADON和15-ADON聯(lián)合作用于A549細胞后的細胞抑制率曲線（以CCK-8法和構(gòu)建的電化學方法作為比較）

用于評估細胞毒性的傳感器適用于各種傳感應(yīng)用，包括毒素檢測和藥物評價。利用細胞作為生物傳感器元件可以在一定程度上模擬人體的生理反應(yīng)，目前也已經(jīng)提出了許多用于毒性評價的生物傳感器的研究。然而大多數(shù)細胞傳感器的構(gòu)建都是基于人工操作，不可避免地會引入人為誤差。本研究開發(fā)了一種基于生物打印的可用于多樣品檢測的電化學傳感器，用于評價DON及其乙酰化衍生物的單一和聯(lián)合毒性。本研究表明，DON、3-ADON和15-ADON以劑量依賴性的方式引起細胞活力的顯著降低，本文中的常規(guī)毒理指標的檢測結(jié)果還發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)環(huán)境信息系統(tǒng)與ROS水平、細胞內(nèi)Ca2+濃度、凋亡率和壞死率均有關(guān)系。該方法簡單、有效，為可批量化地生產(chǎn)毒物的細胞毒性評價工具提供新的方向。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1016/j.bioelechem.2021.107743