近期，浙江大學(xué)劉旭、楊青課題組在超分辨顯微成像領(lǐng)域取得了重要研究進(jìn)展。他們利用移頻成像原理，開(kāi)創(chuàng)性地將發(fā)光納米線環(huán)作為局域光源與二維薄膜波導(dǎo)相耦合，巧妙地利用了納米光源小尺寸、大表體比、強(qiáng)光局域能力和強(qiáng)倏逝場(chǎng)等特點(diǎn)，首次實(shí)現(xiàn)了片上的大視場(chǎng)、遠(yuǎn)場(chǎng)、無(wú)標(biāo)記的超分辨顯微成像，分辨率較傳統(tǒng)顯微方法提升了5倍，且其視場(chǎng)比以往報(bào)道的無(wú)標(biāo)記型遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨顯微方法擴(kuò)展了2個(gè)數(shù)量級(jí)。
“2017中國(guó)光學(xué)十大進(jìn)展”候選推薦
光學(xué)顯微鏡自16世紀(jì)發(fā)明以來(lái)，成為了人們探索微觀世界的重要工具。從列文虎克用自制的顯微鏡首次揭示微生物的存在到集成芯片微小缺陷的檢測(cè)，顯微技術(shù)的發(fā)展在近一個(gè)世紀(jì)的時(shí)間里突飛猛進(jìn)，在1953年、1986年和2014年三次獲得了諾貝爾獎(jiǎng)，極大地促進(jìn)了生物醫(yī)學(xué)、物理和化學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展。
圖1 光學(xué)顯微成像的重要發(fā)展歷程
最初，人們認(rèn)為，只要顯微鏡片的制作足夠精細(xì)，理論上可以觀察到任何微小的尺寸。然而，19世紀(jì)末，德國(guó)物理學(xué)家恩斯特·阿貝發(fā)現(xiàn)了“衍射極限”的存在，即光作為一種波，它的聚焦能力會(huì)受光學(xué)系統(tǒng)的孔徑（Numerical aperture，NA）和光波長(zhǎng)的限制，聚焦光斑的尺寸不可能小于（0.61×λ）/ NA。這一特性限制了在可見(jiàn)光波段顯微成像的分辨能力，使200 nm以下的微小結(jié)構(gòu)無(wú)法被傳統(tǒng)的顯微方法觀察。而打破衍射極限，實(shí)現(xiàn)“超分辨成像”，對(duì)人類(lèi)科學(xué)取得突破性發(fā)展至關(guān)重要，因而成為了國(guó)內(nèi)外研究者孜孜以求的目標(biāo)。
2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了Stefan W. Hell，Eric Betzig 和 William E. Moerner，以表彰他們發(fā)明的受激發(fā)射損耗顯微成像（Stimulated Emission Depletion（STED）microscopy）和單分子顯微成像（Single-molecule Microscopy）將熒光顯微鏡的分辨率提高到了納米量級(jí)，為生物和醫(yī)學(xué)的發(fā)展提供了有力的研究手段。這些技術(shù)首先利用特殊的熒光顆粒對(duì)生物組織進(jìn)行染色標(biāo)記，然后通過(guò)使用熒光顆粒的非線性效應(yīng)而將距離很近的結(jié)構(gòu)分辨開(kāi)來(lái)。但同時(shí)，基于熒光標(biāo)記樣品的成像方法對(duì)熒光顆粒和成像樣品都有著較為嚴(yán)格的要求，普適性不強(qiáng)，且遇到了成像速度慢、易引起生物體排異反應(yīng)等瓶頸。所需要的顯微系統(tǒng)昂貴而復(fù)雜。
相比起來(lái)，非熒光標(biāo)記的超分辨顯微方法在活體成像、多類(lèi)樣品成像和快速成像等方面具有天然的優(yōu)勢(shì)。然而其發(fā)展卻非常緩慢，難以滿(mǎn)足材料、信息、醫(yī)學(xué)和生物科學(xué)等領(lǐng)域在無(wú)標(biāo)記樣品檢測(cè)方面的迫切需求。國(guó)際上多個(gè)知名課題組對(duì)其展開(kāi)研究，微球接觸、極透鏡等技術(shù)相繼被發(fā)明，但仍面臨著光譜范圍單一、視場(chǎng)狹窄等限制。探索并發(fā)展寬視場(chǎng)、遠(yuǎn)場(chǎng)且結(jié)構(gòu)與相位均能快速成像的新型非熒光標(biāo)記超分辨顯微方法成為人們關(guān)注的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。
最近，該課題組利用移頻成像原理（如下視頻中所示），開(kāi)創(chuàng)性地將發(fā)光納米線環(huán)作為局域光源，巧妙地利用其小尺寸、大表面積體積比、強(qiáng)光局域能力和強(qiáng)倏逝場(chǎng)等特點(diǎn)，并與低傳播損耗、高折射率的薄膜波導(dǎo)相耦合，首次實(shí)現(xiàn)了片上的大視場(chǎng)、遠(yuǎn)場(chǎng)、無(wú)標(biāo)記的超分辨顯微成像，分辨率較傳統(tǒng)顯微方法提升了5倍，且其視場(chǎng)比以往報(bào)道的無(wú)標(biāo)記型遠(yuǎn)場(chǎng)超分辨顯微方法擴(kuò)展了2個(gè)數(shù)量級(jí)。
該方法是一種片上移頻顯微術(shù)，整個(gè)結(jié)構(gòu)集成在一片毫米量級(jí)厚，厘米量級(jí)寬的硅片上，將之放入普通顯微系統(tǒng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的載玻片，只需要激發(fā)片上的納米線光源發(fā)出熒光，即可使普通顯微鏡具備超分辨能力，實(shí)現(xiàn)從傳統(tǒng)顯微鏡到超分辨顯微鏡的飛躍提升。結(jié)構(gòu)如圖2 (a)所示。圖2（b）為利用該方法觀察特征尺寸在幾十納米量級(jí)的“ZJU”圖案效果。
圖2 納米線環(huán)形照明顯微術(shù)機(jī)理示意圖(a)及“ZJU”結(jié)構(gòu)觀察效果圖(b)
目前，該技術(shù)在集成芯片、藍(lán)光DVD、3T3-l1癌細(xì)胞等多類(lèi)亞波長(zhǎng)樣品上均得到驗(yàn)證，顯示了其普適性強(qiáng)，使用方便的優(yōu)點(diǎn)。圖3所示為使用該方法觀察藍(lán)光光碟和集成電路的效果圖。納米照明移頻顯微芯片的小尺寸、低功耗和高度兼容性使其在生物醫(yī)學(xué)、集成芯片和材料學(xué)等重要領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，同時(shí)芯片化的設(shè)計(jì)可演化成主板型光學(xué)顯微鏡，為下一代光學(xué)顯微鏡提供顛覆性的設(shè)計(jì)理念。
圖3 NWRIM在藍(lán)光光碟和集成電路上的應(yīng)用效果圖。(a) 藍(lán)光光碟的普通顯微成像；(b) 藍(lán)光光碟在納米線環(huán)照明下的成像；(c) 集成電路的普通顯微成像；(d) 集成電路在納米線環(huán)照明下的成像；(e) 子圖(c)與(d)中白色方框標(biāo)示區(qū)域的電子顯微鏡照片；(f)子圖(c)與(d)中沿藍(lán)色虛線所描繪的成像強(qiáng)度分布。
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