為了監(jiān)測神經(jīng)活動進而理解神經(jīng)系統(tǒng)的功能機制，科學家們研發(fā)了不少高大上的“武器”。

近日，《美國化學會志》期刊報道了一項新研究成果。研究人員開發(fā)了一種可用近紅外光激發(fā)的電壓熒光納米探針，并用它成功監(jiān)測了斑馬魚和小鼠腦中神經(jīng)元膜電位的動態(tài)變化?；铙w監(jiān)測時，這種新“武器”表現(xiàn)不俗。

設計電壓敏感探針一直是個技術(shù)難關

群體神經(jīng)元活動的在體監(jiān)測是揭示神經(jīng)系統(tǒng)功能機制的關鍵。目前，神經(jīng)元鈣離子熒光成像是主要手段之一。然而，相比于神經(jīng)脈沖信號，鈣離子熒光信號的動力學相對較慢，且很難推斷出與之對應的神經(jīng)脈沖的頻率和數(shù)量。因此，神經(jīng)科學界迫切期望能開發(fā)出對細胞膜電位變化敏感、有高信噪比的納米粒子或分子探針，從而實現(xiàn)高時空分辨率、大范圍神經(jīng)元集群電活動的活體監(jiān)測。

現(xiàn)有的熒光電壓探針多用紫外光或可見光激發(fā)，由于這兩種光在活組織中易于吸收和散射，因此它們只能應用于大腦淺層。相比于可見光或紫外光，紅外光（750納米—l000納米）在生物組織中穿透能力更強，穿透深度可達厘米量級，能夠應用于大腦深層，被稱為“生物組織的光學窗口”。“因此，如何研發(fā)高靈敏、可用近紅外光激發(fā)的電壓敏感探針已成為目前國際神經(jīng)科學領域迫切希望攻克的技術(shù)難關之一?！敝袊茖W院腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心/神經(jīng)科學研究所研究員杜久林對科技日報記者說。

稀土元素摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒（UCNPs）是一類近紅外光激發(fā)，紫外、可見光多重發(fā)射的反斯托克斯發(fā)光納米材料。所謂反斯托克斯，即指物質(zhì)的發(fā)射光波長短于激發(fā)光波長的反?，F(xiàn)象。由于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒具有低背景熒光、多重發(fā)射的特性，已在生物成像與活體診療的應用中獲得廣泛關注。

在這項研究中，研究人員設計和制備了一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的電壓敏感探針。研究人員首先將上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒固定在細胞膜上，然后將六硝基二苯胺（DPA）嵌入細胞膜磷脂雙分子層。在細胞靜息狀態(tài)下，帶負電荷的六硝基二苯胺在細胞膜外側(cè)富集，上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒與六硝基二苯胺之間距離在10納米以內(nèi)，形成發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移效應（FRET），上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒發(fā)光被六硝基二苯胺吸收，檢測到的光信號較弱。當細胞去極化后，六硝基二苯胺在電場作用下于細胞膜內(nèi)側(cè)富集，上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒與六硝基二苯胺之間距離超過10納米，發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移效應消失，從而恢復了上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒的發(fā)光。

探究活體組織中神經(jīng)元活動有了新思路

為驗證新研發(fā)的電壓納米探針在神經(jīng)元電活動檢測中的優(yōu)勢，研究人員應用該納米探針分別監(jiān)測了斑馬魚前腦神經(jīng)元的嗅覺反應和小鼠新皮層神經(jīng)元膜電位振蕩隨麻醉深度的變化。

神經(jīng)元的電活動動態(tài)性強，以往開發(fā)的基于熒光蛋白的電壓探針信噪相對較低，大都需要多次疊加才能得到清晰的感覺反應。同時，此類探針易被熒光淬滅，因此可記錄時間窗口較短，限制了其實用性。

“我們運用新開發(fā)的電壓納米探針，研究了斑馬魚前腦神經(jīng)元對食物刺激的反應。在近紅外光激發(fā)下，單次施加食物刺激即可顯著增強神經(jīng)元的熒光信號，并可在連續(xù)數(shù)次刺激下穩(wěn)定記錄。更重要的是，得益于上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒較低的淬滅程度，活體記錄時間可長達30分鐘，為數(shù)據(jù)收集提供了充足的時間窗口?！倍啪昧窒蛴浾呓榻B。

哺乳動物神經(jīng)元膜電位的閾下振蕩，反映了動物個體的腦狀態(tài)及其變化。在深度睡眠和麻醉狀態(tài)下，腦狀態(tài)主要是慢波；在動物趨于清醒時，慢波減弱甚至消失，代之以高頻電活動。傳統(tǒng)的鈣離子成像反映的神經(jīng)活動難以體現(xiàn)這種閾下膜電位振蕩，研究人員在小鼠初級體感皮層中注入電壓納米探針，并考察了戊巴比妥麻醉不同深度下的神經(jīng)元閾下膜電位活動。在深度麻醉狀態(tài)下，納米探針發(fā)光存在低頻振蕩現(xiàn)象，提示此狀態(tài)下閾下膜電位以慢波為主。通過機械刺激小鼠尾巴提高其清醒水平后，納米探針發(fā)光的低頻振蕩減弱，高頻電活動相對增強，在10分鐘后恢復至原有水平。此現(xiàn)象說明納米探針的發(fā)光強度可真實反映腦電活動的相應變化。

對此，杜久林表示，這項研究為設計可用近紅外光激發(fā)的電壓敏感探針提供了全新思路，為探究深層活體組織中群體神經(jīng)元活動開辟了實時動態(tài)監(jiān)測的新方法。