據(jù)悉，來自美國國家標準技術(shù)研究院（NIST）和弗吉尼亞聯(lián)邦大學（VCU）的研究人員現(xiàn)已開發(fā)出一種基于激光納米孔快速加熱方法測量來監(jiān)控分子進出納米孔時能量的自由分布。該研究成果2021年4月21日Science Advances上。

納米多孔系統(tǒng)中聚合物能量學的研究始于1970年代，當時研究的是大分子在其他納米多孔材料中分配給沸石和凝膠的分配系數(shù)。這催生了對受限聚合物鏈的靜態(tài)和動態(tài)特性的理論研究。這項工作的重點是應(yīng)用定標律來理解孔內(nèi)擴散系數(shù)和聚合物分配系數(shù)，這兩者都可以使用使用大量多孔材料來測量分子的整體性質(zhì)的技術(shù)進行研究。盡管這些集成方法提供了對聚合物-孔隙相互作用的重要見解，但單分子納米孔傳感技術(shù)的出現(xiàn)為更基礎(chǔ)的研究聚合物-孔動力學提供了平臺。

使用?？?普朗克方程(Fokker-Plank方程)和聚合物理論的詳細分析，可以在聚合物孔隙動力學與聚合物逸出納米孔的自由能壘之間建立聯(lián)系。之前有大量報告研究了聚合物納米孔的相互作用，提供了潛在井的詳細粗粒度模型和化學特異的分析模型。限制在納米孔中的聚合物自由能的最全面模型包括來自排除的體積效應(yīng)的勢能、分子間鍵的振動模式、外部電場和靜電相互作用。進一步的擴展還包括聚合物與溶劑和電解質(zhì)成分的相互作用，這提供了對中空聚合物在納米孔中模擬電壓依賴性效應(yīng)的能力。

盡管大多數(shù)研究都討論了熵是自由能壘的主要貢獻者，但有證據(jù)表明，焓可以起關(guān)鍵作用，特別是在增強了孔內(nèi)可用靜電相互作用的改性系統(tǒng)中。分離熱力學組分的一種成功方法是用弱相互作用的陽離子（如Li＋）代替弱相互作用的陽離子（如K＋）。但是，更直接的方法是測量聚合物-納米孔動力學隨溫度變化的函數(shù)，以構(gòu)建Arrhenius圖，從中可以明確地提取焓和熵。盡管可以通過紅外燈或密封的Peltier裝置對納米孔裝置進行溫度控制，但是這些實驗的繁瑣和緩慢的特性（即，溫度在每分鐘時間尺度上的變化）將詳細的熱學研究的數(shù)量限制為僅幾個示例。

為了克服靜態(tài)外部溫度控制方法的挑戰(zhàn)，來自弗吉尼亞聯(lián)邦大學和國家標準與技術(shù)研究所 (NIST) 的研究人員使用了基于激光的加熱方法，該方法可以動態(tài)控制局部溫度?？梢酝ㄟ^用紅外光直接激發(fā)水中的振動模式或通過納米等離子輔助加熱以及半導體材料中電子模式的激發(fā)（間接）來實現(xiàn)光學加熱。

該團隊通過制造形成細胞膜的生物材料的人工版本來構(gòu)建其生物傳感器。它被稱為脂質(zhì)雙層，它包含一個直徑約2納米（十億分之一米）的細小孔，周圍被流體包圍。溶解在流體中的離子穿過納米孔，產(chǎn)生小的電流。但是，當將感興趣的分子驅(qū)動到膜中時，它會部分阻止電流流動。這種封鎖的持續(xù)時間和大小可作為指紋，識別特定分子的大小和性質(zhì)。為了對大量的單個分子進行準確的測量，目標分子必須在納米孔中停留的時間既不能太長也不能太短（“ Goldilocks”時間），范圍從百萬分之一秒到十分之一秒。問題在于，如果納米孔以某種方式將它們固定在適當?shù)奈恢?，則大多數(shù)分子僅在此時間間隔內(nèi)停留在納米孔的小體積中。這意味著納米孔環(huán)境必須提供一定的屏障，例如增加靜電力或改變納米孔的形狀，這會使分子更難以逃脫。對于每種類型的分子，突破障礙所需的最小能量各不相同，這對于生物傳感器高效，準確地工作至關(guān)重要。計算該數(shù)量涉及測量與分子進入和移出孔時的分子能量有關(guān)的幾個屬性。至關(guān)重要的是，目標是測量分子與周圍環(huán)境之間的相互作用主要是由化學鍵還是由分子在捕獲和釋放過程中擺動和自由移動的能力引起的。

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▲圖1. 實驗裝置圖和相應(yīng)的加熱軌跡。

(A) 實驗裝置的示意圖。(B) PEG28與納米孔相互作用的典型電流跡線，作為Au-簇的分隔物，進入和流出αHL的前庭。(C) 和 (D) 分別顯示了PEG28和AT1的溫度校準電流，因為聚合物與開孔相互作用。電流（和溫度）由紅外激光通過一個振蕩周期進行調(diào)制。(E) 在24°C下顯示Au-簇（實心正方形）和開孔（空心正方形）構(gòu)型的PEG-αHL停留時間分布。(F) AT1-αHL的停留時間分布顯示為在24°C下具有Au簇（實心正方形）和開孔（空心正方形）構(gòu)型。顯示的數(shù)據(jù)是在70 mV施加跨膜電勢下在3 M KCl中收集的。在所有實驗中，接地電壓均參考孔的反面。(E) 和 (F) 中的誤差線是根據(jù)計算為計數(shù)平方根的1 SD估算的。

到目前為止，由于多種技術(shù)原因，缺少用于提取這些高能成分的可靠測量方法。在這項新研究中，由NIST的Joseph Robertson和VCU的Joseph Reiner共同領(lǐng)導的一個團隊證明了使用基于激光的快速加熱方法測量這些能量的能力。

圖2說明了激光驅(qū)動溫度控制（動態(tài)控制）的優(yōu)點； 在基于激光的加熱條件下觀察到了AT1，并將其與使用靜態(tài)珀爾帖控制溫度控制的類似實驗進行了比較。進行比較的目的是確?；趧討B(tài)激光的溫度調(diào)制不會產(chǎn)生任何意外的系統(tǒng)偏差?；诩す獾募訜崤c整體溶液加熱之間的協(xié)議表明，激光加熱器不會將雜散偽像（即通過對流或輻射傳遞）引入系統(tǒng)。研究人員注意到，由于數(shù)據(jù)收集（包括點之間的溫度平衡）需要30分鐘以上的時間才能生成包含三個離散數(shù)據(jù)點的數(shù)據(jù)集，因此通常無法進行重復的體溫測量。

▲圖2. 整體加熱和基于激光的加熱的Arrhenius圖的比較。

通過基于激光的動態(tài)加熱（空心符號，三個不同的孔）和基于珀爾帖的大量加熱（實心黑圈，一個孔）產(chǎn)生的阿倫尼烏斯圖顯示了方法之間的一致性。實線是對每個數(shù)據(jù)集的最小二乘線性擬合。靜態(tài)加熱條件對應(yīng)于通過嵌入分析室中的PID控制的Peltier設(shè)備進行的溫度控制。動態(tài)加熱條件對應(yīng)于通過AOM調(diào)制的1444 nm激光器進行的溫度控制。靜態(tài)實驗產(chǎn)生了三個離散溫度。靜態(tài)數(shù)據(jù)集的誤差線是根據(jù)觀察到的停留時間的標準偏差估算的。代表性數(shù)據(jù)來自AT1在70 mV和3 M KCl（pH 7.2）中的數(shù)據(jù)。

測量必須在不同的溫度下進行，并且激光加熱系統(tǒng)可確保這些溫度變化快速且可重復地發(fā)生。這使研究人員可以在不到2分鐘的時間內(nèi)完成測量，而原本需要30分鐘或更長時間。沒有這種新型的基于激光的加熱工具，他們的經(jīng)驗表明，根本無法進行測量。因為它們將既耗時又昂貴。實質(zhì)上，研究人員已經(jīng)開發(fā)了一種工具，可以改變納米孔傳感器的開發(fā)流程，以迅速減少涉及傳感器發(fā)現(xiàn)的猜測。

進行能量測量后，它們可以幫助揭示分子如何與納米孔相互作用。然后，科學家可以使用此信息來確定檢測分子的最佳策略。

例如，考慮一個主要通過化學相互作用（基本上是靜電相互作用）與納米孔相互作用的分子。為了達到Goldilocks的捕獲時間，研究人員進行了實驗，對納米孔進行了修飾，以使其對目標分子的靜電吸引既不太強也不太弱。出于這一目標，研究人員用兩個小肽，即構(gòu)成蛋白質(zhì)構(gòu)建基團的化合物的短鏈，展示了該方法。其中一種肽，血管緊張素可穩(wěn)定血壓。另一種肽，神經(jīng)降壓素，有助于調(diào)節(jié)多巴胺，多巴胺是一種影響情緒的神經(jīng)遞質(zhì)，在大腸癌中也可能起作用。這些分子主要通過靜電力與納米孔相互作用。研究人員將納米顆粒中的金納米顆粒插入了帶電材料，從而增強了與分子之間的靜電相互作用。

研究小組還研究了另一種分子，聚乙二醇，其移動能力決定了它在納米孔中花費了多少時間。通常，該分子可以不受環(huán)境的束縛而自由擺動，旋轉(zhuǎn)和伸展。為了增加分子在納米孔中的停留時間，研究人員改變了納米孔的形狀，使分子更難以擠過微小的空腔并退出。

研究人員可以利用這些變化來構(gòu)建適合檢測特定分子的納米孔生物傳感器。最終，研究實驗室可以使用這種生物傳感器來識別感興趣的生物分子，或者醫(yī)生辦公室可以使用該設(shè)備來識別疾病的標記。

本文來源：Christopher E. Angevine et al, Laser-based temperature control to study the roles of entropy and enthalpy in polymer-nanopore interactions, Science Advances (2021). DOI: 10.1126/sciadv.abf5462