水凝膠具有類似于細(xì)胞外基質(zhì)的理化性質(zhì)，具備良好力學(xué)性能、自愈合能力和響應(yīng)性，可以用于構(gòu)建組織再生的微納米仿生結(jié)構(gòu)，并提供微米尺度的表面形態(tài)來調(diào)節(jié)細(xì)胞行為，如細(xì)胞粘附、遷移或生存增殖分化因子的釋放。因此，水凝膠被廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物遞送等領(lǐng)域。然而，制備高精度的三維（3D）任意生物相容性水凝膠支架仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。為了適應(yīng)未來生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展，開發(fā)具有精細(xì)3D幾何結(jié)構(gòu)的新型水凝膠材料勢(shì)在必行。

近日，中國科學(xué)院理化技術(shù)研究所仿生智能界面科學(xué)中心有機(jī)納米光子學(xué)實(shí)驗(yàn)室鄭美玲研究員團(tuán)隊(duì)在ACS Applied Materials & Interfaces上發(fā)表了題為“22 nm Resolution Achieved by Femtosecond Laser Two-Photon Polymerization of a Hyaluronic Acid Vinyl Ester Hydrogel” (DOI: 10.1021/acsami.3c04346）的研究成果，提出了一種真3D高精細(xì)任意可設(shè)計(jì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)調(diào)控單細(xì)胞的新策略。該論文的第一作者為2021級(jí)碩士研究生段琦，通訊作者為鄭美玲研究員。

圖1 3D水凝膠的制備示意圖

作者采用飛秒激光雙光子聚合技術(shù)，以乙烯基酯透明質(zhì)酸（HAVE）水凝膠作為單體材料，P2CK作為高效水溶性雙光子引發(fā)劑，二硫蘇糖醇（DTT）作為硫醇-烯點(diǎn)擊化學(xué)交聯(lián)劑和PBS緩沖溶液配制了HAVE前驅(qū)體，通過配方優(yōu)化和激光焦點(diǎn)調(diào)控在水凝膠結(jié)構(gòu)分辨率上取得了重要突破，最高分辨率達(dá)到22 nm，制備了與細(xì)胞尺寸相當(dāng)?shù)乃z3D微支架并驗(yàn)證了材料與結(jié)構(gòu)的生物相容性，表明HAVE水凝膠細(xì)胞支架可以進(jìn)一步用于研究細(xì)胞遷移和操作等行為。

研究團(tuán)隊(duì)首先開展了配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，通過改變單體和引發(fā)劑的質(zhì)量比及控制硫醇-烯官能團(tuán)比例篩選出溶解性好、易于加工和聚合性能良好的HAVE前驅(qū)體配方。

表1 A-E系列HAVE前驅(qū)體配方優(yōu)化及性能比較

在幾十納米尺度的分辨率中，體素相對(duì)于基底的位置是不可忽略的影響因素。為了進(jìn)一步提高結(jié)構(gòu)分辨率，該團(tuán)隊(duì)根據(jù)激光焦點(diǎn)體素理論調(diào)控焦點(diǎn)與基底相對(duì)位置從而獲得更高分辨率的線結(jié)構(gòu)。如圖2所示，大功率激光焦點(diǎn)光斑明亮，并且體素體積較大，不易得到最佳焦點(diǎn)位置，而小功率激光焦點(diǎn)光斑較弱，體素體積更小，更容易獲得最佳焦點(diǎn)位置，基于此方法獲得了更高分辨率的線結(jié)構(gòu)。

圖2 體素形態(tài)和相對(duì)基底位置對(duì)大功率變化(a)和小功率變化(b)聚合線結(jié)構(gòu)分辨率的影響

通過上述配方優(yōu)化和焦點(diǎn)調(diào)控，開展了HAVE前驅(qū)體C配方的分辨率研究。當(dāng)掃描速度為6 μm/s時(shí)，線結(jié)構(gòu)的質(zhì)量得到了顯著的提高（圖3a），結(jié)構(gòu)完整致密，作者利用HAVE前驅(qū)體C配方實(shí)現(xiàn)了22 nm的分辨率（圖3c）。

圖3 HAVE前驅(qū)體C配方雙光子聚合性能研究

接著，作者對(duì)HAVE前驅(qū)體配方進(jìn)行了3D水凝膠微結(jié)構(gòu)的雙光子聚合加工，利用原子力顯微鏡測(cè)量了3D細(xì)胞支架的楊氏模量，楊氏模量平均值94 kPa接近體內(nèi)組織的力學(xué)性能。作者并對(duì)配方中水溶性引發(fā)劑P2CK和3D細(xì)胞支架進(jìn)行了生物相容性測(cè)試，驗(yàn)證了該材料和結(jié)構(gòu)具有良好的生物相容性。

圖4 A和C配方制備的3D細(xì)胞支架結(jié)構(gòu)的SEM對(duì)比圖以及水凝膠支架上共培養(yǎng)L929細(xì)胞的共聚焦熒光顯微鏡圖像

綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)全面研究了HAVE水凝膠光刻膠的雙光子聚合性能，通過優(yōu)化光刻膠前驅(qū)體的配方和調(diào)節(jié)焦點(diǎn)位置，獲得了22 nm的特征線寬，并驗(yàn)證了材料和3D水凝膠細(xì)胞支架的生物相容性。本研究提出的方案有望創(chuàng)建復(fù)雜的生物相容性3D水凝膠結(jié)構(gòu)，并探索其在個(gè)性化微環(huán)境調(diào)控、組織工程、生物醫(yī)學(xué)和仿生科學(xué)領(lǐng)域的潛在應(yīng)用。

該工作是研究團(tuán)隊(duì)前期一系列仿生水凝膠工作的深入和拓展（Adv. Mater. Technol. 2022, 7, 2200276; ACS Appl. Mater. Interfaces 2021, 13, 27796-27805; ACS Appl. Mater. Interfaces 2019, 11, 1782-1789; ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 42247-42257; Appl. Surf. Sci. 2017, 416, 273-280; J. Mater. Chem. B 2015, 3, 8486-8491; Chem. Soc. Rev. 2015, 44, 5031-5039; J. Mater. Chem. B 2014, 2, 4318-4323）。相關(guān)研究工作得到科技部納米科技重點(diǎn)專項(xiàng)、國家自然科學(xué)面上基金、中國科學(xué)院國際伙伴計(jì)劃等項(xiàng)目的大力支持。