非線性成像技術是一種行之有效的工具，其通過提供獨特的數(shù)據(jù)來幫助生物學家將特定的分子活動與細胞乃至整個生物體的功能和結構緊密聯(lián)系起來。目前有兩大主要發(fā)展趨勢影響著可調諧超快激光器的設計，以實現(xiàn)在衍射極限或近衍射極限情況下的非線性顯微成像：第一是需要更長的波長來實現(xiàn)更深度的成像和更少的光損傷；第二是使用更加靈活的系統(tǒng)來支持多模式成像。同時，系統(tǒng)靈活性不但能減少實驗的建立時間，而且還能令激光器的價值最大化。

　　更寬的調諧范圍和更長的激發(fā)波長

　　非線性成像能夠受益于超快激光光源更寬的調諧范圍，尤其是在長波長區(qū)域。更寬的調諧范圍能夠支持熒光體-染料、指示劑和熒光蛋白的樣品需求，這些樣品在尖端生物學領域的應用不斷增加。此外，對于二次諧波和三次諧波成像而言，更寬的調諧范圍能夠使這些成像技術工作在一個更加合適的波段，而這一波段正好能夠與其他實驗參數(shù)和限制相匹配。最為重要的是，擴展超快顯微鏡激光器的調諧范圍到更長波長，使得對更深層次組織的成像成為可能（見圖1）。

　　圖1：更長的波長實現(xiàn)更深層次的組織成像。圖中小鼠腦部毛細血管的MPE照片，是利用AlexaFluor568和相干公司的ChameleonVisionII激光器實現(xiàn)的雙光子激發(fā)成像。

　    之所以能夠在更深層次的組織中成像，是因為生物樣品的光散射大部分是米氏散射，正比于1/λ4。因此，即使激發(fā)波長有一個很小的增加（如幾十個納米），也會導致散射部分極大的減少，這已被證明是在深組織成像中限制信噪比的一個重要因素。

　　使用更長波長同樣能減少光損傷。例如，曾有研究人員證實，在大多數(shù)植物標本上通過緊聚焦，可以使用平均輸出功率超過100mW的1280nm激光束安全地觀察到持續(xù)的多光子光譜。在同一項研究中，研究人員還發(fā)現(xiàn)當使用波長830nm、平均功率大于10mW的鈦寶石激光束緊聚焦照射樣品時，通常在一秒鐘之內就會觀察到由多光子吸收激發(fā)引起的破壞性等離子體的形成。在一項胚胎研究中[2]，研究人員指出：“很明顯，使用800nm和1250nm高強度光激發(fā)有顯著的不同。較長波長對胚胎的損傷更小，可以認為是安全輻射。”因此，較長波長同樣實現(xiàn)了高功率激光的安全使用，這反過來又促進了最大可能的成像深度。

　　靈活的波長調諧實現(xiàn)多模式成像

　　目前有各種各樣的非線性激發(fā)技術，每一種都適于對不同種類的生物分子和微結構進行成像。例如，相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）通常是通過在2840cm-1附近激發(fā)它們的CH延展振動、從而為脂類成像提供最佳方法。另一方面，多光子激發(fā)（MPE）是用于激發(fā)熒光蛋白、傳統(tǒng)染色劑和內源性熒光樣品熒光的理想方式。而二次諧波和三次諧波技術最適用于膜、膠原蛋白和肌纖維，同樣也能用于一些脂類。因此，研究人員經(jīng)常想在同一個樣品上同時使用這幾種不同的方法（見圖2），或者利用兩個不同波長進行多光子激發(fā)（MPE）。這被稱作多模式成像，理想的激發(fā)光源需要有兩個獨立可調諧的輸出波長。#p#分頁標題#e#

　　圖2：多模式成像案例--偽彩色果蠅幼蟲全身成像。紅色是無標記CARS信號，綠色是雙光子熒光信號。

滿足顯微鏡成像的需求

　　為了滿足長波長激發(fā)的需求，首先要擴展自動鈦寶石激光器的調諧范圍。具體來說，當輸出波長超過1000nm時，鈦寶石的增益便會逐步下降。然而，調諧范圍是可以通過減少損耗和增加泵浦功率來擴展的。例如，相干公司最新的ChameleonVision系列激光器使用的寬帶光學元件具有極低的散射和吸收，配合使用相干公司獨特的18W、532nm泵浦激光器，實現(xiàn)了波長范圍680~1080nm的一鍵式調諧。

　　隨著緊湊型光學參量振蕩器的不斷發(fā)展，如相干公司的ChameleonCompactOPO，人們對使用波長大于1080nm激光的興趣也在不斷增加。通過使用集成式控制器即可輕松將波長調諧至1600nm，操作非常簡便。此外，使用可選的fan-poledOPO晶體，可以讓鈦寶石激光器和OPO在不改變光束指向的條件下實現(xiàn)獨立調諧，這對于多模式成像是非常理想的。現(xiàn)在又增加了一個將OPO輸出倍頻得到可見光的選項，進一步增加了多模式成像的選擇（見圖3）。

　　圖3：Fan-poled晶體的使用，使得鈦寶石振蕩器與OPO能夠實現(xiàn)獨立的大范圍波長調諧。OPO的輸出倍頻進一步擴展了多模式成像能力。圖中顯示了熒光體與成像技術是如何通過多模式成像來相互匹配的。藍色線條代表了頻率間隔為2840cm-1的脂類CARS成像。

　　非線性或多光子成像是超快激光器的重要應用之一。激光器制造商正在從操作的簡便性、調諧范圍和系統(tǒng)靈活性這幾個方面不斷改進超快激光器產(chǎn)品，進一步支持該領域的發(fā)展。