LED技術(shù)正讓我們的生活變得越來(lái)越精彩。過(guò)去的50年里，LED技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)從電子產(chǎn)品中簡(jiǎn)單的指示燈擴(kuò)展到了取代家用照明白熾燈,為地球節(jié)約了數(shù)以太(1012)瓦計(jì)的電力?；谄涓吡炼取⒏呖煽匦约皩捁庾V輸出的特點(diǎn)，LED近期發(fā)展出了一些不為大家所熟知的專(zhuān)業(yè)照明應(yīng)用。
熒光顯微技術(shù)在生命科學(xué)中運(yùn)用廣泛，常常被用來(lái)研究生物樣本，包括單細(xì)胞到整個(gè)組織的樣本。這個(gè)過(guò)程涉及到利用光學(xué)顯微鏡使用特定波長(zhǎng)的光束來(lái)刺激樣品。由于斯托克斯（Stokes）位移——物質(zhì)被光激發(fā)后，產(chǎn)生的電子躍遷（熒光）中，其吸收譜和發(fā)射譜峰值間的波長(zhǎng)差或頻率差，光束重新發(fā)射的熒光波長(zhǎng)大于原激發(fā)光的波長(zhǎng)。而把熒光顯微技術(shù)中傳統(tǒng)使用的燈泡換成LED光源，這一改變?yōu)樵擃I(lǐng)域帶來(lái)的效益遠(yuǎn)不止大大降低運(yùn)行成本。
圖 熒光顯微鏡的基本構(gòu)造。圖片來(lái)源：Luther Hindley/CoolLED公司
作用一：滿(mǎn)足光譜需求
有些研究需要使用活細(xì)胞成像，另一些需要使用被化學(xué)試劑固定于某一特定生命時(shí)期的細(xì)胞。不論何種情況，用于照明樣本的光源類(lèi)型和設(shè)計(jì)對(duì)顯微鏡所需的硬件以及所記錄圖像的質(zhì)量和有效性都有極大的影響。
早期使用LED系統(tǒng)的一個(gè)重要原因在于使用者及實(shí)驗(yàn)管理的便利性。最常見(jiàn)的燈泡，例如100 W高壓汞燈，其壽命很短，約為300小時(shí)。使用者通常會(huì)在記事本上記錄打開(kāi)燈泡的時(shí)間，因?yàn)槿绻褂脽襞莸臅r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)增加爆炸的風(fēng)險(xiǎn)。然而，LED產(chǎn)品的使用壽命長(zhǎng)達(dá)數(shù)萬(wàn)小時(shí)。
燈泡需要預(yù)熱與冷卻，而且一整天都要這樣。而LED光源可以在需要的時(shí)候以電子方式打開(kāi)或關(guān)閉，即在觀察樣本或成像期間打開(kāi)光源，不使用的時(shí)候關(guān)閉。盡管用LED光源替代燈泡的賣(mài)點(diǎn)很多，但同時(shí)存在高亮度及光譜范圍這兩個(gè)主要問(wèn)題，LED光源最初并未被廣泛應(yīng)用。
LED光源發(fā)出的光不是寬光譜而是半峰寬約10 nm至40 nm的類(lèi)高斯光譜。因此光源設(shè)計(jì)人員要使用多個(gè)LED來(lái)滿(mǎn)足研究人員的光譜需求，這就帶來(lái)了光源設(shè)計(jì)過(guò)程中新的光電和機(jī)械復(fù)雜性，而這些問(wèn)題對(duì)于傳統(tǒng)光源來(lái)說(shuō)是不存在的。捕捉和校準(zhǔn)LED芯片的朗伯發(fā)射，然后使用雙色鏡組合出多種顏色，這已經(jīng)成為了標(biāo)準(zhǔn)方法。朗伯定律表明，從漫反射表面觀察到的發(fā)光強(qiáng)度與入射光和表面法線(xiàn)之間夾角θ的余弦值成正比。這種復(fù)雜性和損耗導(dǎo)致大多數(shù)LED光源最多能包含6種不同波長(zhǎng)的光。
一種新穎且已獲得專(zhuān)利的方法采用了波長(zhǎng)組概念，即具有相近光譜的LED光波長(zhǎng)成為一個(gè)用戶(hù)可選擇的通道，根據(jù)對(duì)高速應(yīng)用的需求，可以把四組光譜分離的LED組合在一起。但關(guān)鍵是，某些波長(zhǎng)接近的分組，在相同的樣本中很少會(huì)同時(shí)用到。如今，研究人員可以使用包含16種波長(zhǎng)的LED光源，使用這種方法能夠提高LED的亮度、譜段范圍，也能降低成本。
長(zhǎng)期以來(lái)，燈泡光譜的綠光區(qū)域是最弱的，這部分區(qū)域在固態(tài)照明中被稱(chēng)為“綠色缺口”，也是LED光譜中極其微弱的區(qū)域。一種解決方法是使用由一系列明亮藍(lán)色LED激發(fā)的熒光棒。與單芯片LED相比，在常見(jiàn)的熒光顯微鏡上使用這種方法會(huì)增加成本且使用不方便。對(duì)藍(lán)色LED芯片功率的最新研究提出了更為簡(jiǎn)單的解決方案，即在LED上直接放置熒光劑，且只選擇能夠提供最大綠色光譜區(qū)域的熒光劑。下圖中展現(xiàn)了由明亮綠色LED通過(guò)斯托克斯位移激發(fā)的紅色光。
圖 使用熒光標(biāo)記的牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞。藍(lán)色區(qū)域?yàn)榧?xì)胞核，綠色區(qū)域?yàn)槲⒐艿鞍祝t色區(qū)域?yàn)榧?dòng)蛋白。圖片來(lái)源：Jordi Recasens/Izasa Scientific。
作用二：成像增強(qiáng)
顯微技術(shù)的最終目標(biāo)是獲取優(yōu)質(zhì)圖像。LED由于其固態(tài)特性可作為顯微鏡附件直接使用，無(wú)需重新校準(zhǔn)。采用科勒照明（一種現(xiàn)代科學(xué)光學(xué)顯微鏡下的樣品照明技術(shù)），光源中的光學(xué)器件可將LED成像到顯微鏡物鏡的后孔徑上。這種反向工作的物鏡能夠在樣品的完整視場(chǎng)內(nèi)均勻地分散光線(xiàn)，然而一些LED系統(tǒng)仍使用導(dǎo)光板，以減輕顯微鏡的重量和振動(dòng)。
具有良好的阻擋和傳輸區(qū)域的濾光片能夠改善圖像的信噪比。在用于DAPI（6-二脒基-2-苯基吲哚）熒光團(tuán)成像的典型激發(fā)濾光片和發(fā)射濾光片中，激發(fā)濾光片要擋住汞（Hg）光譜中藍(lán)色區(qū)域的高能量光線(xiàn)。
圖 激發(fā)和發(fā)射濾光片系統(tǒng)中，385 nm LED光和Hg光譜與DAPI的吸收和發(fā)射光譜重疊情況。圖片來(lái)源：Gerard Whoriskey/CoolLED 公司。
相比之下，用于激發(fā)DAPI的LED在相應(yīng)的激發(fā)帶上產(chǎn)生了極低的能量，包括在樣品成像相對(duì)較弱的藍(lán)色區(qū)域。對(duì)比結(jié)果為，使用LED作為光源能夠獲得更好的圖像信噪比，因?yàn)樗鼫p少了樣品的背景色階。愛(ài)丁堡大學(xué)的Sandrine Prost及其同事們的研究表明采用波長(zhǎng)可控的獨(dú)立LED光源，其信噪比的提高超過(guò)了燈泡系統(tǒng)，甚至超過(guò)了一些白色寬頻譜LED光源。
同時(shí)，樣品觀測(cè)結(jié)果也會(huì)受觀察過(guò)程的影響，因?yàn)榧?xì)胞不適合暴露在高強(qiáng)度光線(xiàn)下。不當(dāng)光照的負(fù)面作用包括光漂白和光毒性，隨著時(shí)間推移，光照將導(dǎo)致信號(hào)減弱、活細(xì)胞死亡或行為異常。減少樣品的照明時(shí)間對(duì)降低這些負(fù)面效應(yīng)至關(guān)重要。傳統(tǒng)燈泡光源通過(guò)機(jī)械快門(mén)來(lái)控制曝光，有時(shí)會(huì)造成長(zhǎng)時(shí)間的延遲，導(dǎo)致樣品在相機(jī)的曝光時(shí)間內(nèi)被不必要地照亮。
使用自動(dòng)控制的LED光源則可以解決這個(gè)問(wèn)題。LED的直接邏輯電路（TTL)控制達(dá)到了微秒量級(jí)的開(kāi)/關(guān)時(shí)間，優(yōu)于USB通信方式。許多高端相機(jī)在曝光時(shí)有TTL信號(hào)輸出，該信號(hào)可以直接反饋至LED光源，控制光源開(kāi)/關(guān)，與相機(jī)曝光時(shí)間精確匹配。由于連續(xù)成像兩至三個(gè)熒光團(tuán)很常見(jiàn)，所以最新的LED光源將波長(zhǎng)序列編程到光源內(nèi)，相機(jī)按順序依次進(jìn)行曝光。這種電路連接方式減少了樣品不必要的曝光，而機(jī)械控制的快門(mén)或者電腦控制方法都沒(méi)有實(shí)時(shí)操作系統(tǒng)。
最近，高效節(jié)能的340 nm LED光源已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，可以進(jìn)行鈣熒光指示劑（Fura-2）的成像。這項(xiàng)應(yīng)用可以捕捉到神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的活動(dòng)以便對(duì)阿爾茨海默病和其它類(lèi)似病癥進(jìn)行研究。英國(guó)Strathclyde大學(xué)的Peter Tinning及其同事們的研究表明，使用340nm或380nm的強(qiáng)LED系統(tǒng)，可使細(xì)胞中Fura-2濃度比標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞制備方案低25%。該研究不僅為實(shí)驗(yàn)研究節(jié)省了資金，更重要的是，能夠降低熒光標(biāo)記可能導(dǎo)致的細(xì)胞毒性效應(yīng)，以觀測(cè)到生物樣品更為典型的自然行為。
原文鏈接：
https://www.photonics.com/Article.aspx?AID=62272&PID=2&VID=143&IID=954
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