2. 顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整及顯微鏡檢術概要　顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整，是根據(jù)不同顯微鏡檢術的需要而進行的。所謂顯微鏡檢術（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術與方法。以下簡述顯微鏡檢術中已成熟的幾種方法及對應的顯微鏡成像光路系統(tǒng)的調(diào)整方法。

 　　(1) 透射光明視野（brightfield）　這是自顯微鏡發(fā)明以來最傳統(tǒng)、最普遍的應用方法。 
基本部件：

　　a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察；

　　b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。

　　調(diào)整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好后，即可應用明視野法。

　　適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。

　　注意事項：

　　a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好；

 　　b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中；

　　c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調(diào)節(jié)視野的亮度，更不要亂調(diào)聚光鏡的高低位置，否則，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調(diào)整好的庫勒照明系統(tǒng)；

　　d. 作顯微照相時，每換用一個倍數(shù)的物鏡，就要調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數(shù)值孔徑的2/3 。

　　(2) 透射光相差法（phase-contrast）　這是現(xiàn)代顯微鏡檢術中的一種反差增強法。

　　基本部件：相差物鏡、明視野與相差兼用的多用途聚光鏡、對中望遠鏡、綠色濾光片。

　　調(diào)整方法：

 　　a. 在庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好的基礎上，用明視野方法把樣品調(diào)焦清晰；

　　b. 把聚光鏡轉到Ph1對準轉盤刻度線位置，選用10×相差物鏡，換上待觀察的透明樣品；

　　c. 拔掉其中一個目鏡，換上對中望遠鏡，并調(diào)焦于視野中的兩個相差環(huán)上（物鏡的黑色相差環(huán)和聚光鏡的透光相差環(huán)）；#p#分頁標題#e#

　　d. 視野中的兩個相差環(huán)不一定重合，調(diào)節(jié)聚光鏡上的兩個調(diào)節(jié)裝置（調(diào)整相差環(huán)左右位置的調(diào)節(jié)桿和調(diào)整前后位置的摩擦式轉鈕），使透光環(huán)作前后左右移動而與黑環(huán)重合；

　　e. 調(diào)整好后，換回觀察用目鏡，將綠色濾光片按入光路中，即可觀察到樣品的相差像；

　　f. 有20×和40×物鏡觀察時，聚光鏡應設在Ph2位置上，用100物鏡時，聚光鏡應設在Ph3位置上。

　　適用范圍：適用于觀察透明、未染色或不能染色的樣品，如各種細胞、活組織、未染色或不染色的組織切片、水生生物等。

　　(3) 微分干涉相襯法（differential interference-contrast，DIC）　為了克服相差法觀察時樣品細節(jié)像周圍伴隨有光暈，會掩沒掉本來應該看見的細節(jié)，以及樣品或組織切片厚度要求相當薄，原則上下能厚于10?m等局限性，利用雙光束干涉的原理設計子微分干涉相襯法。

　　調(diào)整方法：

　　a. 必須在庫勒明系統(tǒng)已調(diào)好的基礎上才能調(diào)好DIC方法；

　　b. 先用10×物鏡，以明視野先確定好能把樣品看清晰的物鏡調(diào)焦位置；

　　c. 把起偏器（polarizer）擺入照明光路中，注意其取向應為東—西方向；

　　d. 把聚光鏡轉盤轉到與10×物鏡對應使用的位置上，即DIC 0.3—0.4；

　　e. 在物鏡后方或物鏡轉換器上插入10×物鏡使用的DIC插片（DIC slider）；

　　f. 把檢偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向應為南—北方；

　　g. 換上待觀察的透明樣品，開亮光源把樣品調(diào)焦清晰； 　

　　h. 調(diào)節(jié)DIC插片，使微分干涉相襯的像達到最佳效果，也就是浮雕效果最為明顯；

　　i. 同時可調(diào)節(jié)聚光鏡的孔徑光闌，使反差的效果也達到最佳；

　　j. 然后再細微調(diào)樣品的細節(jié)，可見樣品中不同層面上的結構；

　　k. 如果把補色器（first order red retardation plate）插入，并同時調(diào)節(jié)DIC插片，可在視野中看到不斷變化的絢麗色彩，紅、橙、黃、綠、藍、紫、粉紅、粉紫及金黃色都具有。適用范圍：透明或不能#p#分頁標題#e# 
染色的組織切片，厚度可達100?m左右，培養(yǎng)中的活組織和活細胞、小生生物等。

　　(4) 落射光激發(fā)的熒光法（incident-loght fluorescence Epi-FL）　簡稱為落射熒光法，是近代顯微鏡檢術中新發(fā)展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發(fā)熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經(jīng)反光鏡射入物鏡去激發(fā)樣品，從樣品上被激發(fā)的熒光經(jīng)物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。

        熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發(fā)樣品，只要樣品中含有可產(chǎn)生熒光的成分，它便吸收短波的激發(fā)光而釋放出波長較長的熒光。不同物質(zhì)只能吸改特定波長的激發(fā)光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體，受紫外光激發(fā)后能發(fā)出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質(zhì)吸收激發(fā)光后放出特有熒光的方法稱為自發(fā)熒光法。某些物質(zhì)自身不會吸收激發(fā)光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發(fā)光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質(zhì)，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用于醫(yī)學、生物學及工業(yè)的特異性研究和鑒別上。

　　調(diào)整方法：熒光顯微鏡或附有熒光部件的顯微鏡，調(diào)整的方法大致相同。

　?、?汞燈的安裝

　　a. 打開包裝，取出汞燈將其小心安裝在上電極散熱帽上，安裝時注意手指不能直接接觸燈管和散熱帽的正面，汞燈的封氣口要對向散熱帽的左側或右側；

 　　b. 把汞燈的上電極引張安裝并固定在散熱帽底面的小孔上，再把汞燈的下電極及上電極引線另一端，分別安裝在燈座上各自的插孔中并固定；

　　c. 鎖緊散熱片上的螺絲后，把汞燈連同燈座及散熱帽小心裝入燈室中，鎖緊相應的螺絲，再把燈座上的連線和插座插到汞燈電源后部專用的插座上；

　　d. 詳細的安裝方法請參照有關說明書。

　　② 汞燈燈室在顯微鏡外的初步調(diào)整：

　　a. 接通汞燈電源，讓汞燈預熱10-15min；

　　b. 把汞燈燈室擺放在桌面上，讓汞弧投影到2-3m外的墻上，劃一條與燈室窗口中心線對地高度一樣的水平線作為參考線；

　　c. 轉動燈室調(diào)焦旋鈕，使汞弧的像清晰地投影于墻上；

　　d. 分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，把汞弧的像其反射像調(diào)成并排且盡量靠近，但不要重疊在一起。

　?、?汞燈汞弧在顯微鏡內(nèi)位置的檢驗：#p#分頁標題#e#

　　a. 將汞燈照明光路系統(tǒng)中的視場光闌開到最大；

　　b. 把熒光濾光片組推到藍光激發(fā)的位置上，以避免汞燈中的藍光太刺眼；

　　c. 把觀察的樣品或一塊載玻片放在物臺上，蓋上一張比蓋玻片稍大且潔白的薄紙；

　　d. 取下一個物鏡，使激發(fā)的藍光經(jīng)物鏡轉換器的空檔照在白紙上，白紙上會有一藍色的圓形照明區(qū)域，汞弧的像及其反射像都應該出現(xiàn)在這區(qū)域的中央部位，否則，可調(diào)節(jié)燈室調(diào)焦旋鈕至最清晰，然后分別調(diào)節(jié)燈室外殼上的5個調(diào)節(jié)螺絲孔，直至汞弧的像及其反射像并排在照明區(qū)域的中央位置；

 　　e. 調(diào)好之后，把物鏡裝回去，通過目鏡可見白紙被藍光激發(fā)后發(fā)射出的黃綠色熒光；

　　f. 仔細調(diào)焦，可看清白紙的纖維；取去白紙，樣品上的熒光細節(jié)隱約可見而很容易調(diào)焦清晰。

　　④ 汞燈使用注意事項　目前通常使用的為50W超高氣壓汞燈，燈管內(nèi)通有一對鎢電極和液態(tài)汞（室溫下附在管壁上），未點燃時，管內(nèi)氣壓很低，在燈管的兩電極間施加電壓角發(fā)點燃后，汞氣化為汞蒸氣形成汞弧而產(chǎn)生強光，溫度升高，管內(nèi)氣壓迅速升到10個大氣壓。由于是高氣壓的氣體放電，必須了解其特性才能安全地使 用汞燈。

　　a. 汞燈接通電源后需要10-15min預熱時間，汞才能充分汽化并形成汞弧，產(chǎn)生高亮度而穩(wěn)定的激發(fā)光。因此，觀察前要提早通電；

　　b. 汞燈在使用過程中，不要隨意開關汞燈的電源；

　　c. 關掉汞燈電源后，必須等待15-20min，待汞燈自燃冷卻后才可再次接通電源，違反這一操作規(guī)定時，將會造成嚴重后果。由于汞燈內(nèi)的汞蒸氣未完全液化，汞蒸氣內(nèi)阻很小，一旦通電在兩電極間施加電壓，汞燈內(nèi)形成強大的電流，輕則燒斷保險絲或燒毀汞燈電源中的扼流圈，重則汞燈爆炸，汞蒸氣彌漫整個實驗室，造成工作人員中毒，不僅損失了汞燈，還會炸毀燈室內(nèi)的集光-聚光部件；

　　d. 汞燈的使用壽命一般只有300h，使用得當可達600h，使用壽命與開關的次數(shù)成反比，應集中一批樣呂作2-3h的觀察。汞燈價格及昂貴，應珍惜使用；

 　　e. 汞燈壽命終結的標志是點燃困難，燈管發(fā)黑。

　　5. 暗視野法（dark field）　許多透明或半透明的樣品，如細菌、微生物、細胞內(nèi)的精細結構及結晶體的內(nèi)含物等，在明視野顯微鏡中不容易看清楚，如果采用暗視野法就可以大大提高樣品的可視度。以暗視野法所看到的是襯托在黑暗視野背景中發(fā)亮的樣品輪廓及其細節(jié)。

　　普遍光學顯微鏡的最高分辨率為0.2?m，而暗視野顯微鏡雖然對樣品的細節(jié)構造分辨不清楚，但卻可看到0.004?m以上微細顆粒的存在，即可以看到亞顯微結構，特別適合用來觀察微細的顆粒與細菌等。

　　調(diào)整方法：暗視野法的主要必需部件是暗視野聚光鏡。使用時須先用明視野聚光鏡把庫勒照明系統(tǒng)調(diào)整好。換上暗視野聚光鏡時，要把載玻片（樣品）移開，將浸沒油滴在聚光鏡頂部，再把樣品載玻片擱在物臺上，浸沒油便充填在兩者之間，這種聚光鏡須與裝有可變光闌的100×油鏡配用。另一種中倍率干式暗視野聚光鏡可與中倍率的物鏡配用，這種聚光鏡具有中央光擋，照明光只能透過光檔與聚光鏡邊緣之間的透光環(huán)才能進入聚光鏡內(nèi)。#p#分頁標題#e#

　　對于配備齊全的相差顯微鏡，與編號為Ph3物鏡配用的相差聚光鏡相差環(huán)，可以和 10×及10×以下的相差物鏡配用而形成低倍率的暗視野效果。

　　光學顯微鏡的保養(yǎng)    
 
　　顯微鏡是一種精密的光學儀器，價格普遍較高。從結構上看，顯微鏡由許多光學部件和較精密的金屬零件組成，在使用過程中應特別注意做好保養(yǎng)工作。

　　1. 嚴格按照有關操作規(guī)則使用顯微鏡，避免因使用不當造成損毀。

　　2. 顯微鏡在儲存和使用過程中，普遍存在著生霉起霧問題，霉和霧會使顯微鏡的視場模糊，分辯率下降。為了使顯微鏡保持良好的工作狀態(tài)，延長使用壽命，顯微鏡的工作環(huán)境應保持清潔、干燥、防塵。

　　3. 顯微鏡在每次使用完畢后應及時做好清潔工作，特別是目鏡、物鏡等容易污染的光學部件，如發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)表面有灰塵、指紋、臟物等，應及時用鏡頭紙清潔干凈。

　　4. 顯微鏡工作室最好能安裝空調(diào)、抽濕及防塵裝置。

　　5. 如發(fā)現(xiàn)光學部件內(nèi)部有生霉等現(xiàn)象，最好及時聯(lián)系有關廠家派人清潔、維修。